ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА КОРОВ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ ПО ЛАКТОПРОТЕИНАМ
Татьяна ЛУПОЛОВА, Алла ГАНДЖА, Янина КУЛЕШЕВИЧ

Abstract. Systematic genetic monitoring in populations allows to control the level of genetic diversity, to use the capabilities of marker selection, including the assessment of intra-breed differentiation, the formation of an optimal genealogical structure and selection for heterosis. The article provides information about the genetic structure of the populations of Belarusian Black-and-White cows at the lactoprotein loci CSN3, LALBA, BLG. In two farms at the LALBA, BLG loci, the most frequently encountered (from 42% to 51%) is the heterozygous genotype AB. At the CSN3 locus AA homozygotes were predominant (65% – 72%). Alleles had an almost equal frequency – 61% and 62% for LALBAA and 39% – 38% for LALBAB. The frequencies CSN3A and CSN3B had almost the same values – 0.806 – 0.853 and 0.194 – 0.147, respectively. In genetically equilibrium (χ2 <3.84) cow populations, the occurrence of the BLGA allele was 0.549 and 0.486, BLGB – 0.451 and 0.514. The average heterozygosity is determined at the level of 39.6% – 43.4%.
 

Key words: Cattle; Belarusian black-motley breed; Genotype; Polymorphism; Allele; Heterozygosity; Lactoproteins.

Реферат. Систематический генетический мониторинг в популяциях позволяет контролировать уровень генетического разнообразия, использовать возможности маркерной селекции, включая оценку внутрипо- родной дифференциации, формирование оптимальной генеалогической структуры и селекцию на гетеро- зис. В статье приводится информация о генетической структуре популяций белорусских черно-пестрых коров в локусах лактопротеинов CSN3, LALBA, BLG. В двух хозяйствах, в локусах LALBA, BLG наиболее часто встречаемым – от 42% до 51% является гетерозиготный генотип АВ. В локусе CSN3 преимуществом обладали гомозиготы АА (65 % – 72 %). Аллели имели практически равную частоту – 61 % и 62 % для LALBAA и 39 % – 38 % для LALBAB. Частоты CSN3А и CSN3В имели практически одинаковые значения – 0,806 – 0,853 и 0,194 – 0,147 соответственно. В генетически равновесных (χ2<3,84) популяциях коров, встречаемость аллеля BLGA составила – 0,549 и 0,486, BLGB – 0,451 и 0,514. Средняя гетерозиготность определена на уровне 39,6 % – 43,4 %.

Ключевые слова: Крупный рогатый скот; Белорусская черно-пестрая порода; Генотип; Полиморфизм;
Аллель; Гетерозиготность; Лактопротеины.
 

ВВЕДЕНИЕ
В практике племенной работы для совершенствования животных всё большее применение находят молекулярно-генетические методы. ДНК-маркеры используют в качестве критериев от- бора, выявления генетических аномалий, а так же определения степени родства и генетической гетерогенности (Юльметьева, Ю. и др. 2015). Полиморфизм аллелей генов на уровне ДНК разрешает проводить тестирование аллелей маркерных генов, в том числе, детерминирующих продуктивные признаки, как у молочных коров, так и у быков. Геномная селекция, основанная на анализе полиморфизма генов лактопротеинов CSN3, BLG, LALBA дает информацию о некоторых показателях молочной продуктивности коров, составе бел- ка и качестве молока, что повышает точность племенной оценки коров (Gengler, N. 2016, Харла- мов, А.В. и др. 2019). Немаловажным является поддержание генетической гетерозиготности –генетического разноо- бразия, которая вызвана адаптационной необходимостью не только в природных, но и в селекци- онных популяциях. Именно местные породы хорошо адаптированы к условиям климата, кормовой базе и обладают устойчивым иммунитетом к заболеваниям, распространенным на территории ре- спублики. Уменьшение генотипического разнообразия ставит на грань риска возникновение воз- можных будущих адаптаций у крупного рогатого скота. Гетерозиготность популяции является на- дежной мерой изменчивости, поскольку служит оценкой вероятности того, что два аллеля данного локуса, взятые наугад из генофонда популяции, окажутся различными (Айала, Ф. 1988). Целью исследования явилось определение генетической структуры популяций коров бело- руской черно-пестрой породы в локусах лактопротеинов – CSN3 (каппа-казеина), LALBA (альфа- лактальбумина) и BLG (беталактоглобулина).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследованию подверглись группы животных черно-пестрой породы, филиала «Экспери- ментальная база «Жодино» Республиканского дочернего унитарного предприятия по племенно- му делу «Заречье» и «РУСП «Племенной завод «Красная Звезда». Оценка полиморфизма генов CSN3, LALBA и BLG проводилась на базе РУП «Научно-практический центр Национальной ака- демии наук Беларуси по животноводству», г. Жодино, методом полимеразной цепной реакции. Оценка полиморфизма гена каппа-казеина проводилась путем амплификации фрагмента гена CSN3 с использованием праймеров: CAS1 5´ - ATA GCC AAA TAT ATC CCA ATT CAG T - 3´ CAS2 5´ - TTT ATT AAT AAG TCC ATG AAT CTT G - 3´ Длина амплифицированного фрагмента – 530 п.о. При расщеплении продуктов амплифика- ции рестриктазой HindIII при 37°С были идентифицированы следующие генотипы (рис. 1): 1 2 3 4 5 6

Для амплификации фрагмента гена LALBA настройки ПЦР-программы были следующими: «горячий старт» - 5 мин при 94°С; 35 циклов: денатурация – 1 мин при 94°С, отжиг – 1 мин при 63°С, синтез – 1 мин при 72°С; элонгация – 10 мин при 72°С, с использованием праймеров:
LAC 1: 5´- AAGAGTTGGATGGAATCACC - 3´; LAC 2: 5´- TTCAAATTGCTGGCATCAAGC- 3´ Длина амплифицированного фрагмента – 430 п.о. При расщеплении продуктов амплифика- ции рестриктазой MhII при 37°С установлены следующие генотипы (рис. 2): 1 2 3 4 5 6

Реакцию рестрикции полученных продуктов амплификации гена BLG проводили с использо- ванием эндонуклеазы HaeIII при 37°С следующими праймерами: LG 1: 5´- TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAG - 3´ LG 2: 5´- GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT- 3´ Амплифицированный фрагмент длиной 247 п.о. установил следующие генотипы (рис. 3): 1 2 3 4 5

 

Детекцию результатов трех этапов работы – выделения ДНК, амплификации фрагмента гена и рестрикции продуктов амплификации – осуществляли электрофоретическим методом с последу- ющей визуализацией на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с длиной волны 260 нм при помощи компьютерной видеосистемы и программы VITran. В качестве маркера использовались ДНК плазмиды pBR322, расщепленную рестриктазой AluI, либо рестриктазой BsuRI. Частота аллелей (для двухаллельных систем) была определена по формулам (1, 2). р(A) = (2AA + AB) / 2n, (1) q(B) = (2BB + AB) / 2n, (2) где р (A) – частота аллеля А; q(B) – частота аллеля В. АА, ВВ – число особей с гомозиготным генотипом; АВ – число особей с гетерозиготным генотипом; n – число особей в группах;
Определение генетического равновесия проводилось с помощью теста χ2, согласно закону Харди-Вайнберга, по формуле (3): χ2 = (Ф – Т)2/Т, (3) где Ф – фактическое количество особей в популяции с определенным генотипом; Т – теоретически ожидаемое количество особей.
 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Ген, кодирующий бычий LALBA, локализован у КРС в 5 хромосоме и состоит из 2023 п.н., включая четыре экзона и три интрона. bα-LA характеризуется наличием нескольких полиморфных вариантов: в позициях +15, +21, +54 и –1689, относительно точки старта транскрипции 5′фланки- рующего региона. Вариабельность в этом регионе может приводить к различной способности свя- зывания РНК-полимеразы и факторов транскрипции, участвующих в регуляции экспрессии гена. Учитывая роль α-лактальбумина в биосинтезе лактозы и продукции молока в целом, ген bα- LA может быть использован как потенциальный генетический маркер молочной продуктивности крупного рогатого скота, в частности удойности и белковомолочности. Уровень же проявления признаков молочной продуктивности у коров, несущих в своем геноме аллели А и В гена альфа- лактальбумина различается в зависимости от породной принадлежности (Костюнина, О. 2005). В наших исследованиях было установлено, что наибольшую численность крупного рогатого скота филиала Э/б «Жодино» РУП «Заречье» составил гетерозиготный генотип АВ – 148 особей (51,21%), гомозиготный генотип – LALBAВВ был обнаружен только у 13,49 % особей. На предпри- ятии «РУСП «Племенной завод «Красная Звезда», гетерозиготных АВ и гомозиготных АА особей составило примерно одинаковое количество: 136 (42%) голов и 133 (41%) соответственно. Часто- та гомозиготных особей ВВ – 55 (17%) (табл. 1).

Как можно видеть выше, аллели в анализируемых популяциях имели практически равную частоту – 61 % и 62 % для LALBAA и 39 % –38 % для LALBAB. Исследуемые популяции в локусе LALBA находились в генетическом равновесии в соответ-
ствии с законом Харди-Вайнберга (χ2 = 1,6 –3,85). BLG – является основным сывороточным белком коровьего и овечьего молока(~3 г/л), а также присутствует во многих других видах млекопитающих; заметным исключением являются люди. Его структура, свойства и биологическая роль неоднократно пересматривались. Существуют не- сколько генетических вариантов белка, основные из которых у КРС были помечены как А и В. Из-за ее обилия и простоты очистки она была подвергнута широкому спектру биофизических исследований. Бычий BLG является относительно небольшим белком. До недавнего времени ге- нотип бета-лактоглобулина не включали в программы селекционного процесса, так как поли- морфизм молочных белков можно было оценить только у лактирующих коров, а производители
могли быть оценены тольkо путем типирования молочных белков их дочерей. Благодаря методу ДНК-диагностики стало возможным идентифицировать генотип гена бета-лактоглобулина у про- изводителей и молодняка, что, значительно ускоряет решение селекционных задач.
Возрастающее значение производства белковой продукции диктует необходимость исполь- зования генетических и селекционных методов для повышения экономической эффективности этого производства (Xiang, Lei-Wen et al. 2019).
У коров белорусской черно-пестрой породы в анализируемых хозяйствах (табл. 2), также уста- новлено два аллельных варианта гена BLG, что позволило распределить исследуемые популяции на 3 генотипа: АА, АВ и ВВ. Наибольшую численность составили гетерозиготные генотипы АВ – 139 особей (48%) в РУП «Заречье» и 166 особей (51%) на предприятии «РУСП «Племенной завод «Красная Звезда». Приблизительно одинаковое количество гомозиготных особей распре- делилось по генотипам АА – 71 гол. (25%) и ВВ – 79 гол. (27%) в первой популяции, во второй, генотипом –LALBAАА обладали 95 особей (29%) и LALBAВВ – 63 особи (19%).

В генетически равновесных (χ2 = 0,4) популяциях коров, встречаемость аллеля BLGA составила – 0,549 и 0,486, аллеля BLGB–0,451 и 0,514. Полученные нами данные о структуре гена BLG согласуются с результатами других авторов. Так, в исследованиях Н.Ю. Сафины и др. (2018) у голштинского скота, частота встречаемости аллеля А достигала значения – 0,47, В – 0,53, генотипа АА – 20,8 % (44 гол.), АВ – 49,8 % (105 гол.), ВВ – 29,4 % (62 гол.). Один из наиболее изученных генетических маркеров является ген молочного белка каппа-
казеина, который расположен в 6-й хромосоме. У крупного рогатого скота чаще встречаются аллели А и В этого гена. Они различаются двумя аминокислотными заменами (Thr 136 → Iso и Asp 148 → Ala). Животные с генотипом CSNВВ характеризуются высокой белковомолочностью, их молоко обладает хорошими сыродельческими качествами. Однако, сведения о массовой доле жира и количественных показателях молочной продуктив- ности коров – носителей различных аллелей этого гена имеют весьма противоречивый характер
(Галстян, А. и др. 2016). В этом локусе, преимуществом обладали гомозиготы АА – 188 (65%) в РУП «Заречье», ге- терозиготный генотип – АВ имели 90 особей (31,14%), гомозиготный ВВ– 11(3,81%). В «РУСП «Племенной завод «Красная Звезда», гомозиготные особи, также встречались чаще CSN3АА–72%. Гомозиготный генотип CSN3ВВ в данной популяции составил всего – 2% (табл. 3).

В обеих популяциях частоты CSN3А и CSN3В примерно одинаковы – 0,806–0,853 и 0,194–0,147 со- ответственно. Проверка генетической гипотезы методом χ2 показала генетическое равновесие в стаде. Полиморфизм данного гена, а также более низкая частота встречаемости CSN3В находят под- тверждение и в исследованиях на других породах коров. Не высокая частота аллеля В, установ- лена также у коров черно-пестрой породы молдавского типа, (0,0968), красной эстонской (0,0484)
и голштинской (0,180) пород (Луполова, Т.А. и др. 2017). В связи с тем, что для племенной работы важным является установление ценных генотипов с точки зрения продуктивности, учитывая при этом генетическую изменчивость, необходимым является вычис-
ление гетерозиготности (или гомозиготности) популяций коров по исследуемым генам (табл. 4).

 

Анализируя данные средней гетерозиготности двух популяций видно, что генетическая из- енчивость составляет 39,6 %–43,4 %, что указывает на генетическое разнообразие животных поn анализируемым локусам.

ВЫВОДЫ
В результате исследования обнаружен полиморфизм генов-лактопротеинов CSN3, BLG, LALBA. Установлены три генотипа АА, АВ и ВВ. Наибольшей частотой в двух животноводческих хозяйствах 80,6 % и 85,3 % обладал аллель CSN3 типа А, самой низкой CSN3B– 14,7 % и 19,4 %. Преимуществом обладали гомозиготы АА (65 % – 72 %). В локусах LALBA, BLG наиболее часто встречаемым – от 42 % до 51% оказался гетерозигот- ный генотип. Аллели имели практически равную частоту – 61 % и 62 % для LALBAA и 38 %–39 %
для LALBAB. В генетически равновесных (P ≤ 0,05) популяциях коров, встречаемость аллеля BLGA составила – 0,549 и 0,486, BLGB – 0,451 и 0,514. Таким образом, обнаруженный полиморфизм, равновесные частоты генов, а также установ- ленная гетерозиготность (39,6 %–43,4 %), указывает на генетическое разнообразие, устойчивость генофонда по генам лактопротеинов LALBA, BLG,CSN3 и соответствующий подбор пар для скре- щиваний с желательными генами в анализируемых популяциях.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. АЙАЛА, Ф., КАЙГЕР, Дж. (1988). Современная генетика: Т.3, 332 с. ISBN 5-03 000496-3.
2. ГАЛСТЯН, А.Г. и др. (2016). Научные основы и технологические принципы производства молочных консервов геродиетического назначения. В: Вопросы питания, № 85(5), с. 114-119. ISSN0042-8833.
3. КОСТЮНИНА, О. В. (2005). Молекулярная диагностика генетического полиморфизма основных молочных белков и их связь с технологическими свойствами молока: Диссертация канд. биол. наук. Дубровицы, ВГНИИЖ. 127 с.
4. ЛУПОЛОВА, Т. А., ГУМИНСКАЯ, Е.Ю., ПЕТКУ, В. С., МАКАРОВА А. В. (2017). Парное различие генетической структуры пород крупного рогатого скота по лактопротеинам. In: Ştiinţа agricolа, nr. 1, рр. 99-103. ISSN 1857-0003.
5. САФИНА, Н.Ю. и др. (2018). Полиморфизм гена β-лактоглобулина (LGB) и его взаимосвязь с экономически важными признаками голштинского скота. В: Достижения науки и техники АПК, Т. 32, № 9, с. 78-80. ISSN 0235-2451.
6. САФИНА, Н.Ю., ЮЛЬМЕТЬЕВА, Ю. Р. ШАКИРОВ, Ш.К. (2018). Влияние комплекса полиморфизма генов κ-казеина (CSN3) и пролактина (PRL) на молочную продуктивность коров первотелок голштинской породы. В: Молочнохозяйственный вестник, № 1 (29), с. 74-82. ISSN 2225-4269.
7. ХАРЛАМОВ, А.В., ПАНИН, В.А., КОСИЛОВ, В.И. (2019). Влияние воздействия генов CSN3 и LGB на показатели молочной продуктивности коров (обзор). В: Известия Оренбургского государственного аграрного университета, № 6 (80), с. 223-225. ISSN 2073-0853.
8. ЮЛЬМЕТЬЕВА, Ю.Р., ШАКИРОВ, Ш.К. (2015). Молекулярно-генетические аспекты селекции молочного скота в Республике Татарстан. В: Достижения науки и техники АПК, Т. 29, № 5, с. 83-84. ISSN 0235-2451.
9. GENGLER, N. (2016). Capitalizing on fine milk composition for breed inland management of dairy cows. In: Journal of dairy Science, nr. 99(5), pp. 4071-4079. ISSN 0022-0302.
10. XIANG, LEI-WEN et al. (2019). Interactions of β-Lactoglobulin With Small Molecules. In: Encyclopedia of Food Chemistry, vol. 2, pp. 560-565. ISBN 9780128140451.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
ЛУПОЛОВА Татьяна Анатольевна* https://orcid.org/0000-0003-4604-9267 кандидат с.-х. наук, доцент, Кафедра биологии и экологии, Факультет технолого – биологиче- ский, Учреждение образования «Мозырский государственный педагогический университет име-
ни И.П. Шамякина», Республика Беларусь E-mail: LupolovT@tut.by
ГАНДЖА Алла Ивановна кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, РУП «Научно-практический центр НАН Бела- руси по животноводству», зав. лабораторией молекулярной биотехнологии и ДНК-тестирования, Республика Беларусь
E-mail: belniig@.tut.by; AGandja@mail.ru
КУЛЕШЕВИЧ Янина Павловна https://orcid.org/0000-0003-3826-3933 Факультет технолого-биологический, Учреждение образования «Мозырский государствен- ный педагогический университет имени И.П. Шамякина», Республика Беларусь
E-mail: yanakul18@gmail.com *Corresponding author: LupolovT@tut.by

Received: 10.03.2020
Accepted: 05.05.2020