IMPORTANŢA TESTULUI DE TRANSFORMARE LIMFOBLASTICĂ – INDICATOR AL IMUNITĂŢII CELULARE

Rita GOLBAN
Universitatea Agrară de Stat din Moldova

Abstract. This paper includes scientific research results related to the lymphoblastic transformation test
(LTT) “in vitro” under the action of anticarburising antigens and purified protein derivative, as a result of
stimulation of lymphocytes which are central cells of the immune system. It was studied the mechanism of the
stimulated lymphocytes blastization, which proliferates due to their mitosis and it was practically determined a
cellular population, which corresponds numerically and functionally to an immune high quality answer. At the
same time, it was stated that due to blast transformations, lymphocytes leave the stage of immunological inactivity
and pass to the kinetic stage, being capable to produce specific effects, both on other cells they cooperate with
and on the antigenic substrate, which causes immunological reactions. We have also observed activated
macrophage changes after the re-vaccination in young animals with 15.5% of blasts, compared to the reference
sample where stimulation indices were 3.5%. Modifications of the nonspecific blast are necessary to evaluate the
functional capacity of lymphocytes.
Key words: Lymphoblastic transformation; Antigen; Lymphocyte; Clone; Cellular Immunity.

Rezumat. În lucrare sunt redate rezultatele investigaţiilor ştiinţifice cu privire la efectuarea testului de
transformare limfoblastică (LTT) „ in vitro” sub acţiunea antigenilor anticarbunos şi protein purified derivative,
ca rezultat al stimulării limfocitelor, celule centrale ale sistemului imunitar. S-a studiat mecanismul blastizării
limfocitelor stimulate care proliferează datorită mitozelor acestora şi s-a determinat practic o populaţie celulară ce
corespunde numeric şi funcţional unui răspuns imun de un nivel înalt calitativ. De asemenea s-a constatat că,
graţie transformărilor blastice, limfocitele părăsesc starea de inactivitate imunologică şi trec în starea cinetică,
devenind capabile să producă efecte specifice atât asupra altor celule cu care cooperează, cât şi asupra substratului
antigenic declanşator al reacţiilor imunologice. Concomitent, s-au observat tansformări macrofagale active după
revaccinare la animalele mai tinere, cu 15,5% blaşti, comparativ cu varianta martor, unde indicele de stimulare a
constituit 3,5%. Modificările indicelui de blastizare nespecifică sunt semnificative pentru aprecierea capacităţii
funcţionale a limfocitelor.
Cuvinte-cheie: Transformare limfoblastică; Antigen; Limfocite; Clonă; Imunitate celulară.

INTRODUCERE

Cercetările efectuate în domeniul imunologiei – ştiinţă de vârf a secolului nostru – au determinat o
acumulare de noţiuni teoretice într-un ritm foarte rapid. În acelaşi timp, s-au făcut progrese importante
în diagnostic, metodele imunologice introduse în ultimii ani fiind de mare acurateţe, motiv pentru care
au pătruns tot mai mult în laboratorul clinic.
În concepţia clasică se consideră că activarea funcţiei imunitare are un efect exclusiv benefic,
protector pentru organism. Din aceste considerente sistemul imunitar este tolerant faţă de substanţele
proprii, deoarece a învăţat să le recunoască în timpul vieţii embrionare, dar este dotat cu proprietatea
de a recunoaşte şi de a diferenţia prompt substanţele străine, faţă de care se activează şi le îndepărtează
din organism (Andrieş, L. et al. 2014; Gâjâilă, G. 2014; Siloşi, I. 2014).
Baza celulară a răspunsului imun celular este reprezentată de limfocitele T şi B. Răspunsul imun celular
protejează organismele faţă de agresiunea fungilor, paraziţilor, virusurilor şi bacteriilor cu localizare intracelulară.
Limfocitele T, responsabile de imunitatea celulară, exprimă receptori care recunosc doar scurte secvenţe
peptidice din antigenele proteice (Andrieş, L., Olinescu, A.1992; Gâjâilă, G. 2002; Siloşi, I. 2013).
Mecanismele de reglare a răspunsului imun se bazează pe reacţiile imune, care sunt controlate de
către sisteme de reglare de o complexitate cel puţin egală cu a celor care stau la baza declanşării şi
exprimării lor. În situaţia blocării mecanismelor reglatoare, proliferarea clonală sau sinteza de
imunoglobuline nu mai poate fi limitată, ajungându-se la alterarea profundă a răspunsului imun, însoţită
de instalarea şi evoluţia unor boli care, de regulă, au un sfârşit letal. Totodată factorii care intervin în
imunoreglare sunt foarte numeroşi. Unii dintre aceştea se corelează cu antigenul, cu tipul şi cantitatea
anticorpilor (Taşbac, A. 2014 ).
Testul de transformare limfoblastică (LTT) a fost validat în Europa şi este folosit cu aplicaţii în (111-114)
determinarea imunităţii la animalele intacte şi vaccinate în diagnosticul agenţilor infecţioşi, alergii
medicamentoase, alimentare etc. Testul se bazează pe principiul diviziunii celulare limfocitare induse
de contactul cu antigenul specific.
O reacţie pozitivă la LTT demonstrează existenţa limfocitelor antigen specifice (celule cu memorie)
în sângele animalului. LTT oferă informaţii utile privind capacitatea funcţională a limfocitelor T, prin
evaluarea răspunsurilor proliferative „in vitro” ale acestor celule la diferiţi stimuli.
Din acest considerent, scopul cercetărilor a fost de a studia utilizarea cu perspectivă a testului de
transformare limfoblastică pentru determinarea imunităţii la animalele intacte şi vaccinate.
 

MATERIAL ŞI METODĂ

Testul de transformare limfoblastică la bovinele intacte şi vaccinate anticarbunos a fost efectuat cu
antigenul PPD (protein purified derivative) extras din Mycobacterium tuberculosis. Indicele de
transformare limfoblastică a fost determinat în culturi celulare limfocitare, cultivate în termostat la
temperatura de 37 0C. Au fost recoltate, steril, probe de sânge din vena jugulară (10-15ml), pe heparină,
de la bovine. Probele de sânge au fost lăsate pe 5-6 ore la temperatura camerei în poziţie înclinată.
Ulterior s-a separat plasma sanguină, după care au fost separate limfocitele vizualizate sub forma unui
inel de culoare albă la hotarul stratului eritrocitar şi plasmei sangvine din eprubetă.
Plasma limfocitară a fost recoltată cu pipeta Pasteur în eprubete sterile de centrifugat, ulterior fiind
centrifugate pe parcursul a 5 minute la 1000 rot./min. Stratul supernatant a fost înlăturat. Precipitantul
a fost completat cu Mediul 199, efectuând resuspendarea limfocitelor de trei ori. Suspensia limfocitară,
obţinută în volum de 3,0 ml, a fost repartizată, câte 1,0 ml, în trei eprubete de centrifugat cu M-199,
fiind amestecată cu suspensii antibiotice: penicilină, streptomicină, nistatină pH=7,2-7,4.
Conţinutul primei eprubete a fost constituit din antigen anticarbunos, al eprubetei a doua – din
antigen PPD, iar conţinutul celei de a treia eprubete a servit drept martor. Eprubetele au fost termostatate
la 37 0C, timp de 120 de ore, după care au fost centrifugate pe parcursul a 5 min la 1000 rot/min. Din
sediment au fost prelevate frotiuri, fixate cu metanol şi colorate prin metoda Romanovschii-Giemsa.
Indicele de transformare limfoblastică a fost determinat prin microscopie cu imersie. După numărarea
a 200 celule limfocite şi macrofage s-a exprimat procentual numărul de celule blastice şi de limfocite
netransformate. Numărarea celulelor a fost vizualizată pe trei câmpuri de microscopie, unde celulele
au fost studiate izolat, cu structuri caracteristice bine exprimate.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

Investigarea funcţională a limfocitelor reprezentată de testul de transformare limfoblastică (testul
de blastogeneză, diferenţiere blastică) apreciază capacitatea acestor celule de a reacţiona prompt şi
intens sub influenţa unor stimuli mitogeni (inductori de mitoză) - antigenici sau neantigenici.
Limfocitele sunt considerate a fi unicele celule care pot reveni într-un stadiu precedent al dezvoltării,
adică din limfocite să redevină limfoblaşti. Procesul de blastizare se derulează „in vivo”, dar poate fi
reprodus şi „in vitro”(Fig. 1).

Declanşarea transformării limfoblastice reprezintă rezultatul stimulării limfocitelor din structuri
mitogene. Prin urmare, această inducţie blastogenetică poate fi de tip specific sau nespecific.
În rezultatul cercetărilor efectuate, pe preparatele colorate au fost determinate transformările macrofagale
ale limfocitelor. Sub acţiunea agentului specific PPD s-a determinat stimularea limfocitelor provenite de la
animalele presensibilizate care determină mecanismul stimulării selective a unei anumite clone de limfocite
care recunoaşte antigenul şi, ulterior, limfocitele alogenice într-o cultură mixtă de limfocite.
Intensitatea stimulării limfocitelor a fost evaluată prin determinarea procentuală a blaştilor din
populaţie, procedeu cunoscut sub denumirea de metodă morfologică de evaluare a transformării blastice.
În rezultatul experienţei s-au determinat tansformări macrofagale active după revaccinare la animalele
mai tinere, cu 15,5% blaşti, comparativ cu varianta martor, unde indicele de stimulare a constituit 3,5%.
Indicele de stimulare este considerat pozitiv când valoarea sa constituie 3. Modificările indicelui de blastizare
nespecifică reprezintă semnificaţie evidentă pentru aprecierea capacităţii funcţionale a limfocitelor.
Astfel, scăderea indicelui de stimulare este interpretată ca un indiciu al unui imunodeficit celular,
sugerând reducerea capacităţii de răspuns. Indicii foarte înalţi se traduc prin existenţa unui proces
reactiv în plină evoluţie din partea unor clone de limfocite cu funcţionalitate normală.
Procesul de transformare a limfocitelor în celule macrofage a fost determinat prin mărirea nucleului
şi citoplasmei celulelor. Procentul majoritar al macrofagelor la această etapă de cultivare are o activitate
fagocitară redusă. Prin urmare, în rezultatul vizualizării preparatelor, s-au observat celule macrofage
tinere fără vacuole, cu bazofilie în citoplasmă şi conturul bine determinat al nucleului (Fig. 2).

Transformarea limfoblastică a fost studiată la animalele intacte şi imunizate în scopul determinării
intensivităţii procesului imunologic celular. În rezultatul investigaţiilor efectuate s-a constatat că
transformarea limfoblastică în sângele animalelor imunizate anticarbunos s-a mărit de aproximativ 3
ori în comparaţie cu martorul, ceea ce denotă un înalt nivel de sintetizare a anticorpilor. Investigarea
animalelor mai în vârstă sub acţiunea PPD a determinat transformarea limfoblastică în sângele acestora
cu un procent neînsemnat de formare a blastelor.
Aceste observaţii ne permit să afirmăm că metoda cultivării limfocitelor din sânge pe mediul 199 cu
15% ser taurin şi antibiotice în combinaţie cu antigen anticarbunos şi antigen PPD, poate fi folosită
pentru interpretarea testului de transformare limfoblastică şi, în special, în interpretarea specificităţii
antigen independente a transformării limfoblastice.
 

CONCLUZII

Blastogeneza limfocitară este un fenomen metabolic complex, graţie caruia limfocitele se modifică
morfologic şi comportamental, fapt care le permite să participe la realizarea răspunsului imun. Din
populaţia iniţială a limfocitelor doar o parte se transformă blastic, şi anume acele limfocite care deţin
receptori de membrană corespunzători epitopilor antigenici, declanşatori de reacţie imunitară.
Modificările indicelui de transformare limfoblastică la animalele imunizate, comparativ cu animalele
intacte, a demonstrat un nivel înalt de sinteză al anticorpilor.
S-au constatat tansformări macrofagale active după revaccinare la animalele mai tinere care au
constituit 15,5% blaşti, comparativ cu varianta martor, la care indicele de stimulare a constituit 3,5%.
Modificările indicelui de blastizare nespecifică este semnificativ pentru aprecierea capacităţii funcţionale
a limfocitelor.
Testul de transformare limfoblastică poate fi folosit cu succes la interpretarea caracteristicilor
statusului imunologic şi specificităţii restructurării imunologice.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

1. ANDRIEŞ, L. (2014). Imunologie clinică. Chişinău. 556 p. ISBN 978-9975-53-383-6.
2. ANDRIEŞ, L., OLINESCU, A. (1992). Compendiu de imunologie fundamentală. Chişinău: Ştiinţa. 476 p.
3. GÂJÂILĂ, G. (2003). Sistemul imunitar la suine. Bucureşti: Cartea Universitară. 131 p. ISBN 973-86231-7-0.
4. GÂJÂILĂ, G. (2002). Imunologia analitică. Aspecte fundamentale şi metodologice. Bucureşti: Printech. 224
p. ISBN 973-652-583-X.
5. SILOŞI, I. (2014). Imunologie. Craiova: SITECH. 266 p. ISBN 978-606-11-3717-6.
6. SILOŞI, I. (2013). Investigaţiile de laborator în imunologie clinică. Craiova: Ed. Medicală Universitară. 241 p.
7. TAŞBAC, A. (2014). Îndrumar pentru laboratorul de imunologie veterinară. Ed. a 2-a, rev. şi adăug. Bucureşti:
Larisa Câmpulung Muscel. 170 p. ISBN 978-606-715-271-5.

Data prezentării articolului: 05.05.2015
Data acceptării articolului: 12.08.2015