Inscriete la noutatile noastre
Livrăm gratuit în raza municipiului Chișinău comenzile ce depășesc valoarea de 500 lei.
Telefon
15 Aug 2024
Testele genetice reprezintă un mijloc important în discriminarea dintre situaţiile fiziologice de stimulare antigenică a populaţiilor de limfocite B sau T şi cele patologice de proliferare malignă. Diferenţa fundamentală între cele două situaţii o reprezintă eterogenitatea populaţiei ca răspuns la stimularea antigenică diversă în prima situaţie, comparativ cu existenţa unei populaţii numeroase şi totodată identice (sub formă de clone) în cea de-a doua. Lucrarea de faţă prezintă una dintre metodele genetice pentru stabilirea acestui aspect, caracterizată prin rapiditate în obţinerea rezultatelor, acurateţe, simplitate şi un cost redus comparativ cu alte abordări.
Limfomul canin reprezintă un grup eterogen de cancere, fiind totodată printre cele mai frecvent diagnosticate, cu o prevalenţă în intervalul 7-14%. Există peste 30 de tipuri descrise de limfom canin, cu un comportament extrem de divers, unele beneficiind de o evoluţie rapidă, sub formă acută şi de cele mai multe ori incompatibile cu supravieţuirea, în timp ce altele evoluează lent, cronic(10). Din punctul de vedere al diagnosticului, detecţia unui număr mare de celule tumorale este posibilă utilizând metodele de diagnostic curente, inclusiv examenul citologic şi/sau flowcitometria(6,7,8,11), totuşi caracterizarea unui număr redus de celule implică utilizarea unor tehnici genetice ce prezintă avantajul sensibilităţii net superioare în identificarea reasortării receptorilor pentru antigen(2,8). Testul PARR (PCR for Antigen Receptor Rearrangements) este termenul uzual folosit pentru astfel de tehnici în medicina veterinară, cu menţiunea că nu există o astfel de terminologie în medicina umană(1,2).
Mecanismul genetic al reasortării receptorilor a fost elucidat în anul 1987 de către cercetătorul japonez Susumu Tonegawa, ulterior recompensat cu Premiul Nobel, şi are la bază fenomene de modelare a receptorilor de pe suprafaţa limfocitelor T sau a imunoglobulinelor produse subsecvent de limfocitele B (plasmocite), astfel încât fiecare receptor să recunoască în mod specific un anumit antigen. Regiunile genetice care codifică situsul de legare antigenică variază la nivelul populaţiei de limfocite mature, atât ca lungime, cât şi ca secvenţă nucleotidică, şi sunt consecinţa recombinării a trei segmente genetic distincte: V, D şi, respectiv, J. Secvenţa genetică pentru fiecare receptor este compusă din una dintre variantele segmentului V (aproximativ 80 de astfel de variante au fost descrise la câine), una dintre variantele segmentului D (în total, şase la câine) şi una dintre variantele segmentului J (cinci pentru câine), între care sunt adăugate un număr variabil de nucleotide suplimentare (figura 1A)(1). Aşadar, unicitatea fiecărui receptor este dată de una dintre combinaţiile posibile dintre cele trei segmente, la care se adaugă un număr variabil de nucleotide, fapt ce face ca fragmentul final să aibă dimensiuni extrem de variabile şi semnificative.
Într-o populaţie normală de limfocite stimulate antigenic, o şuşă de limfocite stimulate pentru acelaşi antigen va avea o structură unică şi total diferită faţă de celelalte (atât ca lungime, cât şi ca secvenţă) (figura 1B), în timp ce, în cazul limfomului, fiind vorba de o singură şuşă, întreaga populaţie de limfocite va avea acelaşi tipar genetic (figura 1C). Aşadar, în cazul amplificării prin tehnica PCR a acestui segment, fragmentele amplificate pentru o situaţie fiziologică vor fi numeroase şi cu dimensiuni diferite, în timp ce, pentru limfom, vom avea un singur fragment amplificat de aceeaşi lungime (figura 1D).
În ceea ce priveşte primerii, cel mai frecvent utilizaţi sunt cei pentru amplificarea lanţului greu imunoglobulinic (IgH) pentru limfocitele B, respectiv receptorii gama ai limfocitelor T (TCRy)(2,3,4,5,9,12,13,14).
Extracţia ADN-ului genomic a fost realizată având ca sursă de material biologic raclatul de pe lamele utilizate pentru examenul citologic, prin aplicarea unui protocol customizat (date disponibile la cerere) şi utilizarea tehnologiei QIAamp (Qiagen, Hilden, Germania), cu eluţia ADN-ului într-un volum final de 150µ l. Toate probele au fost examinate anterior (citologie), confirmând sau infirmând suspiciunea de limfom.
Amplificarea (reacţia PCR) a fost realizată utilizând două seturi de primeri pentru regiunile genetice IgH ale limfocitelor B, un set de primeri pentru regiunea TCRy a limfocitelor T şi o regiune de control (Cµ)(8), cu amplificarea în mai multe replicate pentru a contracara eventualele artefacte (două sau trei replicate pentru fiecare regiune amplificată). Kitul utilizat a fost QuantiFast SYBR PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germania), iar ca aparat s-a folosit Q-instrument (QuantaBio, SUA). Profilul termic este prezentat în tabelul 1. Monitorizarea eficienţei şi cineticii reacţiei PCR s-a realizat prin analiza curbelor de amplificare (figura 2). Ulterior, evaluarea clonalităţii a fost realizată prin etapa de topire, cu obţinerea curbelor de topire specifice (figurile 3, 5, 7), respectiv a vârfurilor de topire (figurile 4, 6, 8).
Bibliografie
Anne C. Avery. Molecular Diagnostics of Hematologic Malignancies in Small Animals. Vet Clin Small Anim. 2012;42:97–110.
Burnett RC, Vernau W, Modiano JF, Olver CS, Moore PF, Avery AC: Diagnosis of canine lymphoid neoplasia using clonal rearrangements of antigen receptor genes. Vet Pathol. 2003;40:32–41.
Chaubert P, Baur Chaubert AS, Sattler U, Forster U, Bornand V, Suter M, Welle M. Improved polymerase chain reaction-based method to detect early-stage epitheliotropic T-cell lymphoma (mycosis fungoides) in formalin-fixed, paraffin-embedded skin biopsy specimens of the dog. J Vet Diagn Invest. 2010;22:20–29.
Waugh EM, Gallagher A, Haining H, Johnston PEJ, Marchesi F, Jarrett RF, Morris JS. Optimisation and validation of a PCR for antigen receptor rearrangement (PARR) assay to detect clonality in canine lymphoid malignancies. Vet Immunol Immunopathol. 2016 Dec;182:115–124.
Gentilini F, Calzolari C, Turba ME, Bettini G, Famigli-Bergamini P. GeneScanning analysis of Ig/TCR gene rearrangements to detect clonality in canine lymphomas. Vet Immunol Immunopathol. 2009;127:47–56.
Gibson D, Aubert I, Woods JP, Abrams-Ogg A, Kruth S, Wood RD, Bienzle D. Flow cytometric immunophenotype of canine lymph node aspirates. J Vet Intern Med. 2004;18:710–717.
Greenlee PG, Filippa DA, Quimby FW, Patnaik AK, Calvano SE, Matus RE, Kimmel M, Hurvitz AI, Lieberman PH: Lymphomas in dogs. A morphologic, immunologic, and clinical study. Cancer. 1990;66:480–490.
Langner FAK, Joetzke EA, Nerschbach V, Eberle N, Schuberth H-J, Koy M, Nolte I, Betz D. Detection of clonal antigen receptor gene rearrangement in dogs with lymphoma by real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis. BMC Veterinary Research. 201;10(1):1..
Keller SM, Moore PF. A novel clonality assay for the assessment of canine T cell proliferations. Vet Immunol Immunopathol. 2012;145:410–419.
Purdue University, Cancer Research Department, SUA. https://vet.purdue.edu/wcorc/cancer-research/canine-lymphoma-research.php
Sözmen M, Tasca S, Carli E, De Lorenzi D, Furlanello T, Caldin M. Use of fine needle aspirates and flow cytometry for the diagnosis, classification, and immunophenotyping of canine lymphomas. J Vet Diagn Invest. 2005;17:323–330.
Tamura K, Yagihara H, Isotani M, Ono K, Washizu T, Bonkobara M. Development of the polymerase chain reaction assay based on the canine genome database for detection of monoclonality in B cell lymphoma. Vet Immunol Immunopathol. 2006;110:163–167.
Vernau W, Moore PF. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol. 1999;69:145–164.
Yagihara H, Tamura K, Isotani M, Ono K, Washizu T, Bonkobara M. Genomic organization of the T-cell receptor gamma gene and PCR detection of its clonal rearrangement in canine T-cell lymphoma/leukemia. Vet Immunol Immunopathol. 2007;115:375–382.
SURSA: https://www.medichub.ro/reviste-de-specialitate/practica-veterinara-ro
Apr
23
Hipotiroidismul este o endocrinopatie tot mai prevalentă în rândul câinilor, având o predispoziție de rasă, unele fiind mult mai sensibile decât altele. Cauza principală a acestei afecțiuni este de obicei o boală autoimună, care generează scăderea producției de hormoni tiroidieni. Tabloul clinic descrie letargie, creștere în greutate, alopecie, bradicardie, hipotermie și modificări ale comportamentului. De asemenea, hipotiroidismul poate afecta metabolismul lipidic, provocând hipercolesterolemie și hiperlipidemie, făcând astfel monitorizarea acestora esențială pe parcursul tratamentului. Diagnosticul se bazează pe măsurarea concentrațiilor serice ale hormonilor tiroidieni, cum ar fi T4 total, TSH și alți markeri tiroidieni. Tratamentul de primă linie constă în administrarea de levotiroxină (T4 sintetic), iar doza este ajustată în funcție de răspunsul clinic și de nivelurile serice de tiroxină.
Apr
19
Leucemia limfocitară cronică (CLL) la câini reprezintă o afecțiune hematologică malignă caracterizată prin proliferarea monoclonală neoplazică a limfocitelor mature, în circulația sanguină și în măduva osoasă. Boala are o evoluție lentă și insidioasă, afectând cu precădere animalele adulte și geriatrice, fără a se evidenția o predispoziție specifică în funcție de rasă sau sex. Din punct de vedere clinic, patologia se manifestă prin semne nespecifice, de intensitate redusă în stadiile incipiente, dar care evoluează progresiv, putând conduce în fazele avansate la disfuncție medulară severă și insuficiență multiorganică. Caracteristicile hematologice includ limfocitoză periferică persistentă, însoțită ocazional de o ușoară citopenie. Diagnosticul precoce este esențial pentru un management terapeutic optim, iar acesta se bazează pe evaluarea parametrilor hematologici prin hemoleucogramă, analiza morfologică a frotiurilor de sânge periferic și citometrie în flux, tehnici care permit identificarea și clasificarea limfocitelor neoplazice.
Mar
14
Toxina epsilon (ETX) este sintetizată de tulpinile Clostridium perfringens de tip B şi D, care cauzează enterotoxemie, o afecţiune letală cu un efect semnificativ asupra dezvoltării sectorului zootehnic, în special în rândul ovinelor. Toxina epsilon aparţine grupului toxinelor formatoare de pori de tip aerolizină. Deşi ETX prezintă similitudini cu toxinele din această familie, efectul letal este indus de doze mai mici, respectiv DL50 pentru şoareci fiind de 100 ng/kg. ETX este considerată un potenţial agent de bioterorism şi a fost clasificată ca agent biologic de categoria B de către Centrul pentru Controlul şi Prevenirea Bolilor (CDC) din Statele Unite. Protoxina este convertită într-o toxină activă prin scindare proteolitică efectuată de proteaze specifice. ETX este absorbită şi acţionează local în intestine, iar ulterior se leagă şi induce leziuni în alte organe, inclusiv rinichi, pulmoni şi sistemul nervos central. Relevanţa acestei toxine pentru medicina veterinară, precum şi potenţialul utilizării ETX ca armă biologică au captat interesul cercetătorilor, generând un volum considerabil de studii dedicate investigării ETX.
Mar
03
Cardiomiopatia dilatativă (DCM) la câini se caracterizează prin extinderea ventriculară şi atrială, precum şi prin disfuncţie sistolică şi diastolică, cu insuficienţă cardiacă congestivă (ICC) care apare adesea într-un anumit stadiu. Cardiologia veterinară recunoaşte rolul fundamental al remodelării cardiace în evoluţia nefavorabilă a afecţiunilor cardiace. Aceasta a desfăşurat un obiect de studiu pentru terapiile ulterioare menite să restabilească cadrul cardiac la starea sa naturală. Prin urmare, studiul clinico-anatomic este menit să coroboreze date morfometrice ale ventriculului stâng şi ale inelului atrioventricular stâng la câinii cu cardiomiopatii degenerative, utilizate şi aplicate atât de des în ecocardiografie şi RX pentru a descrie valorile de referinţă în această afecţiune. În domeniul veterinar există o disponibilitate redusă a studiilor morfometrice în cazul unui cord normal şi remodelat; în plus, geometria ventriculară acţionează ca un indicator al funcţiei cardiace. Este un domeniu de cunoaştere extrem de necesar pentru dezvoltarea protocoalelor terapeutice, în special a celor chirurgicale.
Inscriete la noutatile noastre