INDICI ANTIMICROBIENI AI UNOR TULPINI DE MICROMICETE UTILIZATE ÎN TRATAMENTUL LOCII AMERICANE

Veronica BUGNEAC
Universitatea Agrară de Stat din Moldova

Abstract.

The aimof our investigations was to make the screening of 21 strains of micromycetes (Penicillium)
fromthe NationalCollection ofNonpathogenicMicroorganisms of the Institute ofMicrobiology and Biotechnology
of the Academy of Sciences of Moldova, in order to establish their antimicrobial effect on the causal agent of
American foul brood Paenibacillus larvae. The tested strains were isolated from soil samples taken from the
central region of the Republic of Moldova. Malt agar and Czapek medium served as nutrient mediums for the
isolation of micromycetes.Micromycetes cultivationwas carried out in the thermostat at the temperature of 28oC
for 14 days. Out of the 21 tested cultures, only 6 strains possessed high antibacterial properties against
Paenibacillus larvae, the diameter of inhibition zone of the pathogen ranging from10.2 ± 1.1mmto 2.5 ± 2.31mm.
Two strains possessing the most intense antimicrobial activity were selected for subsequent investigations. The
diameter of the inhibition zone of Paenibacillus larvae when treated with exometabolites of this two strains
constituted 22-23 mm, which is equivalent to the effect of neomycin.
Key words: Penicillium; Antimicrobial properties; Paenibacillus larvae; Honey bees.

Rezumat.

În studiul de faţă s-a realizat screeningul a 21 tulpini de micromicete (Penicillium) din Colecţia
Naţională deMicroorganisme non-patogene de la Institutul deMicrobiologie alAcademiei de Ştiinţe aMoldovei
pentru a se deterimina acţiunea antimicrobiană a acestora faţă de agentul patogen al locii americane Paenibacillus
larvae. Tulpinile testate au fost izolate din probele de sol prelevate din zona centrală a Moldovei. Ca mediu
nutritiv pentru izolareamicromicetelor a servit malţ-agarul şimediulCzapek. Cultivareamicromicetelor s-a efectuat
în termostat, la temperatura de 28oC, timp de 14 zile. Din cele 21 de culturi testate, numai 6 tulpini posedă
proprietăţi antibacteriene faţă de Paenibacillus larvae, diametrul zonei de inhibiţie a patogenului variind între
10.2 ± 1.1 mm şi 2.5 ± 2.31. Pentru cercetările ulterioare au fost selectate 2 tulpini, care posedă cea mai intensă
activitate antimicrobiană. Diametrul zonei de inhibiţie a patogenului Paenibacillus larvae la tratarea cu
exometaboliţi ai acestor tulpini constituie 22-23 mm, ceea ce este echivalent cu acţiunea antibioticului neomicina.
Cuvinte-cheie: Penicillium; Proprietăţi antimicrobiene; Paenibacillus larvae;Albine.

INTRODUCERE
Apicultura este una dintre cele mai vechi activităţi care s-a dezvoltat în condiţii naturale favorabile
privind clima, relieful şi vegetaţia. Pentru societate apicultura are o importanţă primordială atât prin
aportul pe care îl asigură la menţinerea echilibrului ecologic şi biologic în natură, cât şi prin produsele
directe ale stupului, care reprezintă o sursă de venit (Eremia, N. 2009; Pavliuc, P. et al. 2006). Tendinţele
şi cerinţele actuale de dezvoltare în apicultură sunt de a menţine produsul de miere câtmai ecologic, fără
reziduuri de antibiotice, pentru a putea fi exportat pe piaţa Uniunii Europene (Acha, P. et al. 2003;
Ruttner, F. 1980). Programele de monitorizare şi de supraveghere în acest sens sunt axate pe normele
sanitar-veterinare care prevăd examinări clinice sistematice ale familiilor de albine, prelevarea de probe
de material biologic pentru investigaţii de laborator, iar măsurile de însănătoşire se bazează pe metode
radicale de asanare. Este cunoscut faptul că albinele, ca şi alte vietăţi, sunt supuse unor riscuri de
contaminare cudiferite boli de origine infecţioasă. În aceste situaţii, tratamentele cupreparate antibacteriene
sunt limitate sau chiar interzise (Pavliuc, P. et al. 2006). Din aceste considerente, scopul investigaţiilor
noastre a fost de a efectua un screening al unor tulpini de micromicete cu acţiune antimicrobiană pentru
a fi ulterior utilizate în combaterea bolilor de originemicotică şi bacteriană la familiile de albine.
În ultimii ani, micromicetele reprezintă sursa principală a biotehnologieimoderne pentru producerea
unui spectru larg de substanţe bioactive în care se utilizează cu succes microorganismele, fapt determinat
de caracteristicile tehnologicepreţioase: ciclul scurt dedezvoltare, posibilitatea cultivării în condiţiile reglării
şiobţinerii sistemelor enzimatice cu o componenţăprognozată a unei cantităţi nelimitate de diferite substanţe
bioactive. Un rol aparte îl au micromicetele din genul Penicillium. Utilizarea activităţii biochimice a
micromicetelor din genul Penicillium şi-a găsit întrebuinţarea în medicină şi farmaceutică, precum şi la
obţinerea substanţelor bioactive utilizate în diferite ramuri ale economiei (Bebear, C. 1996).
Drept obiect de studiu au servit 21 de izolanţi de micromicete din Colecţia Naţională de
Microorganisme Nepatogene (CNMN) şi tulpina de bacterii Paenibacillus larvae. Tulpinile de
micromicete testate (21 de tulpini) au fost izolate din probele de sol prelevate din zona centrală a
Moldovei.
Ca mediu nutritiv pentru izolarea micromicetelor a servit malţ-agarul şimediul Czapek.Mediul de
păstrare a micromicetelor în CNMN este malţ-agarul. Componenţa mediului nutritiv malţ-agar (g/l):
agar – 20; extract de malţ 6 (Ba) – 1 litru; pH – 5,5–6,0.
Componenţa mediului nutritiv Czapek (g/l): zaharoză – 30; NaNO3 – 2,0; K2HPO4 – 1,0; Mg
SO4x7H2O – 0,5; KCl – 0,5; FeSO4x7H2O – 0,01; agar – 20,0; apă distilată – 1l; pH – 6,5–7,0.
Cultivarea tulpinilor de micromicete izolate s-a efectuat în termostat, la temperatura de 28oC, timp
de 14 zile. Culturile au fost examinate vizual, după caracterele morfoculturale, dar şi microscopic
(Bebear, C. 1996).
În calitate de cultură-test a servit bacteria Paenibacillus larvae, agentul patogen al locii americane
la albinele Apis mellifera.
Tulpina patogenă Paenibacillus larvae a fost izolată din probele prelevate dintr-un stup de albine
şi păstrată în condiţii de laborator pe mediu agarizat.
Pentru izolarea şi păstrarea în condiţii de laborator a tulpinii de bacterii Paenibacillus larvae a fost
utilizatmediulBrainHeart Infusion (BHI) (agar cu adaos de vitaminaB6). Componenţamediului nutritiv
BrainHeart Infusion (BHI) (g/l):Brain infusion solids – 12,5;Beef heart infusionsolids – 5,0; peptocomplex
– 10,0; glucoză – 2,0; NaCl – 5,0; Na2HPO4 – 2,5; agar – 15,0; tiamină - 0,1%; pH – 7,4.
Proprietăţile antimicrobiene ale izolanţilor de micromicete au fost studiate conform metodei
difuzimetrice, prin utilizarea blocurilor de geloză. Metoda este bazată pe capacitatea de difuziune a
metaboliţilor produşi demicroorganismele studiate în profunzimea agarului şi a acţiunii substanţei active
din zona de difuzie asupra culturilor-test.
Descrierea metodei:
1) Soluţia de spori (1 ml) ai micromicetelor testate se însămânţează pe mediul malţ-agar repartizat
în plăci Petri.
2) Incubarea are loc în termostat (la 28oC) timp de 4 zile, în care hifele ating un grad mediu de
dezvoltare.
3) După 4 zile se însămânţează în plăci Petri, pemediul BHI agar cu adaos de vitamina B6, pe calea
incorporării unui ml suspenzie bacteriană (Paenibacillus larvae).
4) Din plăcile Petri cu bacteria Paenibacillus larvae se scot blocuri de geloză cu diametrul de 8
mm, care sunt înlocuite cu blocuri de aceeaşi dimensiune de micromicete luate din plăcile Petri cu
micromicetele crescute deja timp de 4 zile.
5) Incubarea în termostat (la 28oC) a plăcilor Petri timp de 48 de ore.
După 2 zile de incubare, pe suprafaţa plăcii Petri, în jurul blocurilor introduse, apar zone de liză, în
care bacteria Paenibacillus larvae nu creşte. Diametrul zonei de inhibiţie a bacteriei Paenibacillus
larvae denotă intensitatea antagonismului dintre aceste microorganisme.
Ca martor au servit discurile impregnate cu antibioticele neomicina şi canamicina.
Pentru descrierea proprietăţilor morfoculturale ale izolanţilor cu potenţial antimicrobian, tulpinile de
micromicete selectate au fost cultivate pe diferite medii agarizate: malţ-agar; Czapek; raistrick; amidonoamoniacal.
Descrierea proprietăţilor s-a efectuat peste 4,7 şi 14 zile de cultivare la temperatura de 28-30oC.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

Rezultatele cercetărilor efectuate sunt prezentate în tabelul 1, din care se observă că, din 21 de
culturi testate, numai 6 tulpini posedă proprietăţi antibacteriene faţă de Paenibacillus larvae (P. sp.
52, 62, 91, 97, 104, 110).Diametrul zonei de inhibiţie a fitopatogenului variază în limitele a 10,2 ± 1,1mm
(P. sp. 104) pînă la 2,5 ± 2,31 mm (P. sp. 110). Astfel, diametrul zonei de inhibiţe marcat de către
tulpinile P. sp. 91 şi P. sp. 110 este egal cu diametrul zonei de inhibiţie faţă de antibioticul canamicina
şimaimic comparativ cu antibioticul neomicina.

Conform rezultatelor prezentate, diametrul maxim de inhibiţie a patogenului Paenibacillus larvae a
fost înregistrat la tulpinile P. sp. 91 şi P. sp. 110, constituind 20,3 ± 1,8mm şi, respectiv, 20,5 ± 2,31mm.
Având în vedere rezultatele obţinute, pentru cercetările ulterioare au fost selectate tulpinile P. sp 91 şi P. sp.
110, care posedă cea mai intensă activitate antimicrobiană faţă de patogenul testat Paenibacillus larvae.

CONCLUZII
1. În rezultatul screeningului efectuat, din 21 de tulpini demicromicete au fost selectate tulpinile P.sp. 91 şi P. sp. 110, cu potenţial antibacterial sporit faţă de patogenul Paenibacillus larvae.
2. Diametrul zonei de inhibiţie a patogenului Paenibacillus larvae la tratarea cu exometaboliţi aitulpinilor P. sp. 91 şi P. sp. 110 constituie 22-23 mm, ceea ce este echivalent cu acţiunea antibioticului neomicina.
Figura 2. Activitatea antimicrobiană a tulpinilor de micromicete testate faţă de patogenul Paenibacillus larvae
Figura 3. Zonele de inhibiţie a patogenului Paenibacillus larvae: centru - neomicină, stânga – P. sp 104
3. Activitatea antibacteriană maximală a tulpinilor P. sp. 91 şi P. sp. 110 faţă de Paenibacillus larvae a fost obţinută la cultivarea acestora pe mediul malţ-agar.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

1. ACHA, P.N ., SZYFRES, B. (2001). Zoonoses and communicable diseases common to man and animals.
Volume 1. Bacterioses and mycoses. Third edition.Washington, D.C., pp. 168-179. ISBN 92-75-31580-9.
2. BEBEAR, C. (1996). Introductory remarks of Section C: Antibiotic sensitivity testing. In: Molecular and
Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol. II. Diagnostic procedures. London: Academic Press. pp. 181-
183. ISBN978-0-12-583806-1.
3. EREMIA,N. (2009).Apicultura.Chişinău. 331 p. ISBN978-9975-9823-6-8.
4. EREMIA,N., EREMIA,Nina. (2011). Pčelovodstvo. Chişinău: Print-Caro. 531 p. ISBN 978-9975-56-007-8.
5. PAVLIUC, P., CONDRATIUC, S. (2006). Efectele produselor apicole, apicultura ecologică şi sănătatea
omului. Chişinău. 184 p. ISBN9975-78-446-1.
6. RUTTNER, F. (1980). Creşterea mătcilor: Baze biologice şi indicaţii tehnice. Bucureşti:Apimondia. 332 p.

Data prezentării articolului: 21.04.2016
Data acceptării articolului: 25.05.2016