Mecanismele de apărare imună în perioada peri- și post-partum la vacă

Statusul sanitar al vacilor lactante înalt productive este supus riscului apariției infecțiilor uterine în perioada de tranziție, care include ultimele 3 săptămâni de gestație și primele 3 săptămâni după parturiție, reprezentate de puerperium.

Dr. Constantin Nicolae Tiberiu- doctorand, Facultatea de Medicină Veterinară București
Prof. Univ. Dr. Alin Bîrțoiu - Facultatea de Medicină Veterinară București

În această perioadă femela este supusă unor modificări fiziologice care pot determina supresia mecanismelor de apărare celulară și umorală ale gazdei crescând susceptibilitatea la infecțiile uterine și ale glandei mamare. Dintre factorii care pot influența gradul de imunosupresie la fătare, pot fi amintite: modificările de nutriție, creșterea nivelului de cortizol (inclusiv cel fetal) și fluctuațiile hormonilor sexuali.
Relaxarea vulvei și dilatarea cervixului în timpul parturiției și după aceasta, permite accesul bacteriilor în uter, cauzând infecții în procent de 80-100% în primele 14-21 zile postpartum. Raportul dezechilibrat dintre infecțiile uterine și mecanismele proprii de apărare intrauterină conduc la apariția unor tulburări ale aparatului genital precum: metritele puerperale, endometritele clinice, piometrul și endometritele subclinice.

Raportul dintre embrion și uterul matern

Embrionul își semnalează prezența cătresistemul imun maternal prin secreția de chemokine (citokine chemoatractante) și citokine care reglează funcția leucocitară. Factorul responsabil pentru acest fenomen a fost numit in trecut „trofoblastina“ care a devenit cunoscut ulterior sub denumirea de proteina-1 trofoblastică bovină sau interferon τ (tau) (IFNT). Secreția de IFNT începe în stadiul timpuriu de blastocist (a 14 zi de gestație), crescând progresiv când embrionul inițiază elongația trofoblastică (între 17-19 zile de gestație), iar apoi descrește până la
un nivel nedetectabil la sfârșitul perioadei de nidație. Genele IFNT provin din genele IFNω aparținând rumegătoarelor Pecora (care prezentau un apendice frontal) atunci când s-au separat de mamifere cu aproximativ 24-36 milioane de ani în
urmă.
Concentrația de IFNT este proporțională cu dimensiunile embrionului. Astfel, într-o gestație gemelară embrionul de talie mai mare va secreta de 10 ori mai mult IFNT față de embrionul de talie mică. Rolul primordial al IFNT este acela de a inhiba eliberarea de la nivel uterin
de PgF2α și indirect apariția luteolizei. Această inhibare determină reducerea receptorilor pentru ocitocină prezenți pe celulele endometriale.

Imunitatea înnăscută este primordială pentru eliminarea bacteriilor de la nivel uterin. Acest sistem include bariere anatomice și fiziologice care previn pătrunderea bacteriilor și bariere celulare care neutralizează bacteriile (în particular fagocitoza realizată de neutrofile),
dar unele infecții pot fi stopate doar prin mobilizarea răspunsului imun umoral și celular adaptativ.

Contaminarea bacteriană a uterului puerperal

Deseori uterul este contaminat de către bacterii în timpul actului montei sau în timpul parturiției, uneori cauzând infertilitate.În timpul parturiției, barierele fizice ale cervixului, vaginului și vulvei sunt compromise oferind posibilitatea bacteriilor
de a pătrunde din mediul exterior în tractul genital. Vacile susceptibile la infecțiile bacteriene sunt reprezentate de cele înalt productive, cele care au avut fătări distocice, cele care au prezentat retenția anexelor fetale (apare într-un procent de 4-12%), femelele cu fătări gemelare, cu fătări
premature, cu fetus macerat, primiparele, vacile care au avortat, care au suferit de prolaps uterin, sau cele care au avut boli metabolice (cetoză, hipocalcemie, etc.). O listă completă a bacteriilor implicate în infecțiile uterine a fost realizată de Williams și col. (2005) care au izolat
pe culturi bacteriene anaerobe și aerobe probe prelevate de la un număr de 328 de vaci (tabel 1).

Cele mai frecvent izolate bacterii au fost E. coli, T. pyogenes, F. necrophorum, P. melaninogenica. Se crede că aceste 4 bacterii acționează sinergic sporind riscul apariției endometritelor clinice. Metritele puerperale și endometritele clinice, produse de către bacterii, ating deseori
20-40% din efectivul de vaci, însă inci- dența endometritelor subclinice est probabil și mai crescută. Aceste infecții perturbă ciclul ovarian supresând creșterea foliculară și luteoliza.
Unii cercetători subliniază faptul că o mare parte dintre vacile cu endometrite se vindecă spontan în primele 4 săptămâni postpartum.

Barierele anatomice, fiziologice și chimice

Tractul genital, deseori reprezintă o barieră care stopează pătrunderea patogenilor. Vulva este prima linie de apărare împotriva contaminării cu fecale. Vestibulul vaginal (cu sfincterul său) și cervixul (care după 96 ore postpartum permite pasajul a două degete) falduri mucoase cartilaginoase care formează un sistem greu de străpuns. Straturile musculare circulare și longitudinale ale uterului realizează expulzarea fizică a bacteriilor împreună cu mucusul secretat de glandele endometriale.
Endometrul însuși reprezintă o barieră fiind acoperit de un epiteliu columnar simplu sau pseudostratificat. Celulele epiteliale sunt primele care iau contactul cu potențialii patogeni, iar împreună cu celulele stromale crează legături importante pentru funcția endometrului.

Fagocitoza și celulele implicate în acest proces

Prima linie de apărare contra organismelor patogene include neutrofilele, monocitele și macrofagele. Eliminarea infecțiilor bacteriene prin procesul de fagocitoză implică recrutarea neutrofilelor de la nivelul circulației sangvine și de la nivelul măduvei hematogene prin
chemotaxis către locul infecției. Influxul de neutrofile împreună cu diapedeza din lumenul uterin sunt favorizate de următorii factori: puterea chemotactică eliberată de citokinele de la nivel endometrial, vasodilatația uterină ca răspuns la acțiunea interleukinei 1 și permeabilitatea
vasculară crescută ca rezultat al produșilor degranulați de către mastocit. Activitatea fagocitară a neutrofilelor este potențată de sistemul complement și de către anticorpi. Neutrofilele sunt influențate de către peak-ul prepartum
de glucocorticoizi determinând neutropenie, datorită migrării neutrofilelor la nivel uterin și la nivelul glandei mamare. Funcția neutrofilelor este scăzută cu 15 zile înainte de fătare și în primele 30 zile postpartum la vacile lactante înalt productive,
în special cele care au dezvoltat infecții uterine.

Activitatea fagocitară de la nivel uterin este atribuită într-un procent de 80% neutrofilelor restul de 20% fiind realizată de macrofage.
Fagocitoza induce fenomene care pot fi realizate prin două căi acestea depinzând de rezistența bacteriilor: prima cale, fără opsonizare (există o interacțiune directă între celula fagocitară și antigen), iar cea de-a doua cale, cu opsonizare (interacțiunea necesită o moleculă adițională, opsonină, care joacă rol adaptor între bacterie și leucocit). Fagocitoza se continuă cu adeziunea, apoi cu faza în care pseudopodele înconjoară bacteria. Faza finală de distrugere oferă digestia completă a bacteriei.

Imunitatea înnăscută este primordială pentru eliminarea bacteriilor de la nivel uterin. Acest sistem include bariere anatomice și fiziologice care previn pătrunderea bacteriilor și bariere celulare care neutralizează bacteriile (în particular fagocitoza realizată de neutrofile), dar unele
infecții pot fi stopate doar prin mobilizarea răspunsului imun umoral și celular adaptativ.

Apărarea adaptativă imună a uterului. Imunitatea umorală

Imunitatea umorală este reprezentată de moleculele de antigen specifice circulante care se numesc imunoglobuline produse de către plasmocitele care derivă din limfocitele B. Cu toate că celulele secretoare de anticorpi sunt prezente în uterul bovin, contribuția lor la imunitatea locală nu este cunoscută. Imunoglobulinele din clasa A,G și M au fost identificate în secrețiile genitale ale vacilor, reflectând inflamația endometrului consecutivă contaminării bacteriene. Inocularea intrauterină a Trueperella pyogenes a determinat creșterea secreției imunoglobulinelor specifice.
Un alt exemplu este reprezentat de vacile imunizate cu Campylobacter fetus subsp. venerealis, A. pyogenes sau Histophilus somni (Haemophilus somnus). La aceste vaci a fost raportată prezența anticorpilor în secrețiile uterine și cervico-vaginale. Imunoglobulinele
acționează fie lizând direct bacteria, fie prin opsonizare facilitând fagocitoza sau prin activarea sistemului complement din lumenul uterin. Ig G predomină în lumenul uterin în timp ce Ig A se găsește în treimea posterioară a aparatului genital (în mare parte vagin). Principalul mod
de acțiune al Ig A este acela de a inhiba sau de a neutraliza adeziunea bacteriană la epiteliul uterin, fără apariția unor fenomene de natură inflamatorie. Ig G ia naștere din două fracții: prima este sintetizată în endometru (Ig G1), în timp ce fracția a doua provine din
serul periferic circulant (Ig G2). Ig G activează sistemul complement. Tipul de Ig G specific produs la nivelul tractului reproducător poate să depindă de natura antigenului stimulant. De exemplu, infec-ția produsă de Tritrichomonas fetus este caracterizată de răspunsul limfocitului
Th și de producere de IL4 și Ig G1, în timp ce infecția cu Brucella abortus stimulează răspunsul Th1 caracterizată de producerea de Ig G2, IFNγ și limfocit Tc. Ig G poate, de asemenea, să opsonizeze bacteriile pentru fagocitoza neutrofilelor și macrofagelor. Ig M este
secretată timpuriu jucând un rol decisiv pentru aglutinarea și activarea sistemului complement, responsabil de liza patogenului.
Activarea imunității mediate celular Către sfârșitul gestației, limfocitele și macrofagele se localizează în endometrul intercaruncular, dar nu și în endometrul caruncular, indicând faptul că răspunsul imun este local și specific ariei adiacente țesutului fetal. Stroma
uterină subepitelială este larg drenată de o rețea limfatică infiltrată de plasmocite, macrofage prezentatoare de antigen și mastocite, comparativ cu alte regiuni ale endometrului și miometrului. Limfocitul T la nivel uterin este reprezentat de limfocitul T citotoxic
sau CD8+, care recunoaște antigenul transportat de moleculele de tip I ale complexului major de histocompatibilitate (CMH), și de către limfocitul T helper sau CD4+ care recunoaște antigenul transportat de moleculele de tip II ale CMH. Procentul de CD4+ la vacile clinic
sănătoase este de aproximativ 25-35%.
Limfocitele Th sunt de două ori mai multe în stratul superficial al stromei față de stratul profund, și predomină în jurul ductelor glandelor uterine. Populația celulelor endometriale diferă în funcție de stadiul gestației. De exemplu, procentul de limfocite T din circulația periferică se modifică de la 45% în mijlocul lactației, la 20% în perioada peripartum.
Raportul dintre CD4+ și CD8+ este deseori folosit ca indicator al statusului imunitar.Vacile cu infecții subclinice au un raport scăzut, în timp ce vacile cu infecții clinice au un raport crescut în timpul puerperiumului.

Pattern-ul de recunoaștere moleculară asociat patogenului (PAMP)

Prezența microbilor invadanți și a distrucției tisulare sunt detectate de către „celulele santinelă“ (macrofage, celule dendritice și mastocite). După recunoașterea patogenului, celulele imune eliberează molecule proinflamatorii reprezentate de factorul de necroză tumorală-α (TNFα), interleukine (IL1, IL6, IL8, IL12) și oxid nitric. Aceste molecule sunt complice la recrutarea și activarea altor celule imune și, de asemenea, stimulează hepatocitele să secrete proteine de fază acută. Astfel, nu este de mirare că nivelul plasmatic de proteine de fază acută crește în apropiere de parturiție
la vacă, iar apoi scade odată cu eliminarea concomitentă a bacteriilor și cu involuția uterină.
Majoritatea PAMPs sunt molecule componente ale peretelui bacterian sau ale acizilor nucleici. Componentele peretelui bacterian au fost considerate ca cele mai studiate PAMPs și probabil cele mai importante la nivelul endometrului. Bacteriile Gram negative se deosebesc
în primul rând prin prezența lipopolizaharidelor de la nivelul membranei externe a peretelui celular. Comparativ cu acestea, bacteriile Gram pozitive, au în componența lor peptidoglicani și acid lipoteichoic

Receptorii de recunoaștere ai pattern-ului (PRRs)

Acești receptori au rolul de a sesiza prezența microorganismelor prin recunoașterea PAMPs specifici microbilor. Studii recente au scos la iveală faptul că PRRs sunt responsabili de recunoașterea moleculelor endogene eliberate în urma distrucției celulare numite pattern-uri
moleculare asociate distrugerii celulare (DAMPs). PRRs include proteine transmembranare precum receptori Toll-like (TLRs), receptori lectinici de tipul C (CLRs), precum și celule citoplasmatice reprezentate de receptori ai genei de inducere a
acidului retinoic (RLRs) și receptori NOD-like (NLRs).
Dintre aceștia, receptorii TLRs sunt principalele molecule care sesisează infecția la mamifere. Se cunosc în genomul mamifer 13 membri ai receptorilor TLRs. TLR1, TLR2 și TLR6 recunosc lipidele bacteriene, precum acidul lipoteichoic în timp ce TLR3, TLR7, TLR8 și TLR9 recunosc
acizii nucleici aparținând virusurilor, iar în mod particular pentru TLR9, ADN-ul bacterian. TLR11 recunoaște moleculele aparținând protozoarelor, iar TLR10 nu se cunoaște ce structură microbiană recunoaște. Receptorii TLR4 recunosc lipopolizaharidele aparținând membranei
externe a peretelui bacteriilor Gram negative, precum E. coli și piolizina aparținând Trueperella pyogenes, iar TLR5 se leagă cu flagelina. Lipopolizaharidele sunt extrase din peretele bacterian și transferate către receptorii TLR4 de două proteine accesorii, proteina de legare a lipopolizaharidelor
(LBP) și CD14. Endometrul vacilor exprimă receptorii TLR1-TLR10, în timp ce populația de celule epiteliale ale endometrului exprimă receptorii TLR1-7 și 9, iar celulele stromale exprimă receptorii TLR1-4, 6, 7, 9 și 10. La specia bovină, doar receptorii TLR4
au fost studiați în detaliu la nivelul celulelor endometriale. S-a arătat faptul că celulele stromale și epiteliale bovine exprimă transcriptori pentru TLR4 reprezentați de complexul de receptori CD14, care este necesar recunoașterii lipopolizaharidelor.
Activarea receptorilor TLR4 de către lipopolizaharide induce semnale prin două căi: calea dependentă și independentă de MyD88. Receptorii NLRs sunt un alt grup de PRRs; dintre aceștia, NOD1 detectează peptidoglicanii peretelui bacterian care conțin acid γ-D-glutamyl-mesodiaminopimelic
produs de majoritatea bacteriilor Gram negative și pozitive.
Receptorii NOD2 recunosc dipeptidul muralil conservat în peptidoglicanii acelorași tipuri bacteriene. Unele studii recente au prezentat faptul că receptorii NOD1 și NOD2 pot să recunoască și microbii extracelulari. Vacile lactante, înainte de fătare, au o descreștere marcantă a receptorilor
NOD1 aparținând neutrofilelor fiind asociată cu creșterea riscului apariției de infecții uterine. Neutrofilele obținute de la vacile aflate în perioada periparturientă au prezentat o scădere sau o absență a receptorilor NOD1 ARNm.

Citokinele

Atunci când un agent infecțios este expus celulelor santinelă, embrionului, limfocitelor periferice, celulelor oviductale sau endometriale, acestea secretă diferite tipuri de molecule. Aceste molecule includ citokinele majore cum sunt interleukina 1 (IL1) și factorul de necroză tumorală α (TNFα), precum și alte tipuri de interleukine, precum IL6, IL12 și IL18. Tot în acest moment sunt eliberați oxidanți (O2-, H2O2, OH, și NO) și lipide (leukotriene și prostaglandine). Citokinele acționează ca mesagerii dintre locul leziunii și hepatocitele care sintetizează proteinele de fază acută.
Concentrația serică de citokine crește la câteva ore după apariția stimulului, iar apoi dispare din circulație la câteva ore. Proteinele de fază acută din linia a doua (heptaglobina și amiloidul seric A) sunt induse de IL6 și se caracterizează printr‑o creștere a concentrației serice care rămâne ridicată cel puțin 2 săptămâni. S-a observat că în timpul parturiției la nivelul cervixului sunt secretate IL1, TNFα și IL6. În ceea ce privește IL1β, IL6, IL8, TNFα, chemokinele, sintaza 2 prostaglandin- endoperoxidaza și heptaglobina
sunt implicate în mecanisme fiziologice de la nivelul endometrului bovin. IL8 joacă un rol central în procesul de migrare al granulocitelor, în mod particular pentru neutrofilele atractante din uterul bovin. A apărut ipoteza conform căreia concentrația de IL8 ar scădea la
începutul lactației și ar crește la sfârșitul acesteia la vacile care dezvoltă endometrite. IL1 sporește concentrația plasmatică de calciu care stimulează contracțiile mioepiteliale și eliminarea conținutului patologic de la nivel uterin. Măsurarea concentrației prepartum de IL1 are
potențialul de a prezenta statusul imunologic al animalului împotriva bolilor uterine postpartum. Pe baza scăderii nivelului circulant de IL1 la 15 zile înainte de fătare sau în preajma fătării se pot identifica vacile susceptibile dezvoltării infecțiilor uterine postpartum. IL1α reglează producția de PgE2 și PgF2α de la nivelul endometrului în timpul ciclului estral. Nivelul crescut de IL6 s-a asociat cu endometritele, în timp ce un nivel scăzut a indicat retenția învelitorilor fetale.